实验三
质粒DNA的提取http://wenku.baidu.com/view/8d8c06bd960590c69ec376a7.html
实验

目的
....基本原理

基本原
理

..掌握碱裂解法提取质粒的原
理
..了解实验中所使用的试剂的作
用
..技术操
作
..碱裂解法抽提大肠杆菌质粒DNA

什么是质粒（plasmid）？什么是质粒（plasmid）？
..质粒是染色体外的稳定遗传因
子
..大小1-200Kb
..双链、闭环、超螺旋DNA
..主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞
中
..自主复制和转录，并表达所携带的遗传信息
。

碱裂解法抽提质粒DNA碱裂解法抽提质粒DNA
....基本原理基本原理

质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差
异来达到的目的。

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由

于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结
构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相
互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复
中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状
构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是质粒DNA复性迅速
而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部
分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒
可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

染色体DNA与质粒DNA复性的差异

材料与试剂材料与试剂

1、E.coli
5а(
含
pUC18或19质粒)
质粒pUC18/19的结构示意图质粒pUC18/19的结构示意图

2EDTA（10mmol/L）
溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（
25mmol/L

2、溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris HCl（
25mmol/L，
pH8pH8 0）；.0）

3、溶液Ⅱ
：
NaOH （0.2mol/L）；SDS
（
1%，新鲜配制
4、溶液Ⅲ
：
60ml
的
5mol/L KAC
；
11.5ml的冰醋酸
；
28.5ml水

溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是
增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。
EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分
子的降解作用子的降解作用。
Tris.Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。
NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。
溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，
使DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。
溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小
分子的质粒DNA分离。

5. Tris饱和酚：使蛋白质变性而沉淀。
6.
氯仿+异戊醇（24：1）：氯仿使蛋白质变性，但比酚缓和；
异戊醇可防治溶液起泡
。
7.
无水乙醇：夺取DNA外的水合层使DNA聚合而沉淀
8. 70%乙醇：与无水乙醇的作用类似，同时可以清洗DNA，溶
解与DNA一起沉淀下来的离子
。
9.
ＴＥ缓冲液（pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
10.RNaseA酶：降解RNA污染物

实验步骤实验步骤
(一)培养细菌使质粒扩增

()培养细菌使质粒扩
增

1.挑取琼脂培养板上的单菌落
至
2ml LB培养液中（含
2ml LB培养液中（
含
Amp200μg/ml) ３７℃摇荡
过

37℃

夜
。

振摇过

2.取0.5ml菌液转接到一个含
有
50 ml LB培养液三角瓶中(含
Amp200
μg/ml
）, ３７℃摇
荡过夜
。

3737℃
振摇过

(二)收集和裂解细菌
3．收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管
(二)收集和裂解细菌
3．收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管
注：倒净培养液；需要的话将
中，12000rpm离心1min，弃上清，离心管倒置于吸水纸上，或用
取沉淀
。 移液器移除残余的液体

4．溶解菌体：将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，强裂振荡混匀。注(注) ：加溶液加溶液ⅡⅡ几分钟后几分钟后，溶(溶)

5．变性：加入200μl溶液Ⅱ，盖严液变粘稠、变澄清。
管盖轻柔颠倒5-6次以混匀内容物
，
冰上放置5分
钟

冰上放置5分钟
。

6．复性：加入150μl溶液Ⅲ，温和注：加溶液Ⅲ几分钟后，染
色体DNA与蛋白质开始形
振荡数次，冰上放置５分钟
。
成白色沉淀

7．12000rpm 离心５分钟，取上清移注：质粒DNA留在上清液中，
到１个新的Ep管中。染色体DNA与蛋白质作为沉淀
染色体DNA与蛋白质作为沉淀
而留在管底。

保护层保护层
（水相）

9（水相）(三)分离和纯化质粒DNA
．取上清
（
≈ 420ul），分别加
饱和酚
（
0.25
入1/2体积酚(210ul)，和1/2体
％
8-
羟
积氯仿/异戊醇（24:１）
基喹啉
）
Triste饱和酚
(210 l)涡旋震荡混匀溶
液
(210ul)，涡旋震荡混匀溶液。

注：取用酚时，要取底层的液体，勿水相：质粒DNA
取上层的保护
层

蛋白质沉淀：白

10. 12000rpm、离
心
5分钟。
11. 小心移取上清液
（
≈ 400μl)
至另一个新1.5mlEpp管中
。
氯
异戊醇有机相：酚/(/) /(/)
注：取上清时不可搅动蛋白质沉淀
；
尽量不要吸起蛋白质沉淀
。

12．
预冷无水乙醇，混匀，于
（
-20℃中静置
上清液加入２倍体积
（
≈ 800ul ）注20 ℃过夜可获得更高的质）注：-20 ℃过夜可获得更高的质
粒产率。低温下DNA溶解度小。
0.5h。
13.12000rpm, 离心5分钟
。
14（弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，注：“70%乙醇洗涤”可选做

14.（弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，
盖严管盖颠倒数次，１２000rpm 离
心
10分钟。
）
15．干燥DNA：用移液器小心吸走上清液，注：不可吹得太干，否则DNA
然后瞬时离心，再将残余的少量液体移不易溶解。
走，用温和的电吹风吹干DNA沉淀（以
看不到液滴为准）
。
16．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，
不含DNA酶）溶解DNA，-20℃下保存备
用。

预期实验结
果

预期实验结
果

质粒在正常情况下以共价闭合环
状
cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在，
在提取过程中由于机械力酸碱度试剂等的原因可能会使DNA链发生

在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生
断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环
(；

DNA((cccDNA))；；开环DNA(ocDNA）；线形DNA((LDNA))

质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式

本节内容回顾本节内容回顾
..质粒DNA的特点（性质
）
..质粒DNA的特点（性质
）
..分离质粒DNA的原
理
..试剂的作
用
..提取质粒DNA的步骤
..提取质粒DNA的步骤

思考题

思考题思考题：

思考题
：
1、质粒的基本性质有哪些
？
沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在低温高盐条

2(2) 、沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在低温、高盐条

件下进行？

高盐沉淀DNA的原因：在pH为8左右的溶液中，DNA分子

高盐沉淀DNA的原因：在pH为8左右的溶液中，DNA分子是
带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分
子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于
互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。

下次实验内容下次实验内容
..DNA浓度和纯度检
测
..PCR产物和质粒的凝胶电泳检
测
..PCR产物和质粒的凝胶电泳检
测
..完成实验1-3的实验报告。